|
|
Cancer Immunotherapy exploiting engineered antibody fragments against prostate-specific membrane antigen
Das, Gargi ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent) ; Ormsby, Tereza (oponent)
(Czech) Rakovina prostaty (PCa) představuje jednu z hlavních příčin mortality související s rakovinou v populaci mužů. Tento stav vyžaduje vývoj nových terapeutických přístupů přesahujících současnou konvenční léčbu s omezenou účinností. Prostatický specifický membránový antigen (PSMA) je jedním z nejpokročilejších biomarkerů pro zobrazování i terapii PCa díky své expresi specificky výrazně zvýšené neoplastických tkáních PCa a v metastatickém kastračně rezistentním karcinomu prostaty. Imunoterapeutické postupy zaměřené na PSMA skýtají v současné době velký potenciál jakožto nová platforma pro účinnou léčbu onemocnění. Předkládaná doktorská práce je zaměřena na inženýrství protilátkových fragmentů a fúzních proteinů odvozených z vysoce afinní monoklonální protilátky 5D3 specificky rozpoznávající PSMA. Cílem vývoje těchto molekul bylo dosažení specifického spojení imunitních buněk s biomarkerem PSMA vyvolávajícího eliminaci buněk prezentujících tento antigen. Za tímto účelem jsme zkonstruovali jednořetězcové variabilní fragmenty (scFv) protilátky 5D3, které byly následně fúzovány se sekvencemi anti-CD3 scFv a CP33, čímž jsme vytvořili fúzní proteiny specificky spojující imunitní buňky s T lymfocyty (BiTE) nebo s monocyty (5D3-CP33). Fúzní molekuly byly produkovány pomocí hmyzího expresního systému,...
|
|
|
Buněčné a molekulární charakteristiky hemolymfy u raků
KIFAYATULLAH, NA
Celulární a molekulární složky hemolymfy jsou hlavní součástí vrozeného imunitního systému u desetinožců. Hlubší znalosti složek hemolymfy, včetně hemocytů a proteinů hemolymfy, mohou zlepšit naše chápání vrozené imunity u korýšů. Pro studium celulárních a molekulárních aspektů koagulace a fagocytózy jsme využili transmisní elektronovou mikroskopii a kvantitativní proteomiku. Kapitola 2 přehledně shrnuje celulární a molekulární parametry vrozeného imunitního systému a účinky environmentálních stresorů a jejich abiotických a biotických stresových mechanismů u desetinožců. Vrozený imunitní systém desetinožců se silně opírá o hemocyty. Obecně jsou přijímány tři typy hemocytů na základě jejich morfologie, avšak stále existuje nedostatek shody ohledně klasifikace typů hemocytů. Klíčové funkce vrozené imunity, jako jsou koagulace a fagocytóza, jsou stále špatně pochopeny a vyžadují další zkoumání zejména na molekulární úrovni. Environmentální stresory mohou negativně ovlivnit imunitní odpovědi desetinožců, čímž zvyšují jejich náchylnost k nemocem. Avšak abiotický stresový mechanismus je špatně pochopen kvůli nedostatku dostupné literatury a vyžaduje další zkoumání. V kapitole 3 byla transmisní elektronová mikroskopie použita k prozkoumání ultrastrukturního chování hemocytů během koagulace a fagocytózy v raných stadiích zranění amputace nohy u raka mramorovaného Procambarus virginalis. Granulární hemocyty byly aktivovány jako první a morfologie cytoplazmatických granulí se změnila z elektronově hustých na elektronově průsvitné formy v expanzivním způsobu. Transformované granule obsahující amorfní elektronově průsvitné materiály se sloučily a vypustily svůj obsah do extracelulárního prostoru pro koagulaci. Pozorovali jsme, že zbývající jádro z degranulovaných hemocytů se podílí na procesu koagulace, což by mohlo být v některých předchozích studiích zaměněno s hyalinocyty. Kromě toho amputace nohy způsobila masivní degeneraci svalů, následovanou významným přílivem fagocytických hemocytů, které odstranily značné množství svalových vláken a organel, jako jsou mitochondrie, generované z rozpadajících se a rozkládajících se svalů. Dále jsme zjistili, že fagocytické hemocyty obsahují různé počty granulí v cytoplazmě a poprvé jsme objevili, že tyto buňky začleňují nekrotická tělíska vzniklá z degenerovaných svalů do svých organel, jako jsou cytoplazmatické granule a jádro. Granulární hemocyty byly nalezeny jako hlavní buňky provádějící fagocytickou aktivitu na místě zranění. Tato studie poskytuje poprvé komplexní popis všech stadií morfologických změn hemocytů během koagulace a fagocytózy po zranění u raků. V kapitole 4 proteomická analýza sražených a nesražených vzorků ukázala, že množství většiny proteinů zůstalo během koagulačního procesu nezměněno, což naznačuje, že nezbytné proteiny pro koagulaci jsou předem syntetizovány a uloženy před vznikem sraženiny. Díky svému otevřenému oběhovému systému mají desetinožci robustní koagulační mechanismy. Po zranění jsou uvolněny předem syntetizované koagulační faktory, což vede ke vzniku sraženiny. Proto byly pouze některé proteiny, jako jsou proteiny obsahující domény C-typu lektinu, laminin A řetězec a tropomyosin, během srážení sníženy, což naznačuje jejich možné role ve strukturní integritě buněk. Jejich snížení by mohlo usnadnit degranulaci, klíčový krok pro vznik sraženiny.
|
|
|
Interakce Borrelia sp. s buňkami HL-60 a monocyty a kultivace Anaplasma phagocytophilum na buňkách HL-60
Marková, Lucie ; Hulínská, Dagmar (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Borrelia burgdorferi sensu lato a Anaplasma phagocytophilum jsou mikroorganismy způsobující onemocnění lymeskou borreliózu a lidskou granulomatózní anaplasmózu. Jejich společným vektorem v Evropě jsou klíšťata rodu Ixodes. V naší práci jsme se zaměřili na interakce buněk nespecifické imunitní odpovědi s původci lymeské borreliózy, které jsou svou funkcí v časné fázi onemocnění nezastupitelné. Anaplasma phagocytophilum je obtížně kultivovatelný mikroorganizmus, který je možno kultivovat pouze na buněčných kulturách. Úspěšná kultivace Anaplasma phagocytophilum z pacientů z naší geografické oblasti je klíčová pro další experimenty a také důležitá z diagnostického hlediska. V našich experimentech jsme používali ověřené tkáňové kultury buněk HL-60, psích monocytů DH82 a myších monocytů P388D1. Při studiu interakcí původců lymeské borreliózy s buňkami jsme používali dva kmeny odlišných druhů Borrelia. Borrelia garinii M192 a Borrelia burgdorferi sensu stricto B31. Tyto dva kmeny se liší virulencí. Kmen M192 je virulentní, kdežto kmen B31 již pasážováním svou virulenci ztratil. Zaměřili jsme se na studium morfologických změn pomocí světelné mikroskopie (pozorování barevných fixovaných preparátů a pozorování v temném poli), případně transmisní elektronové mikroskopie. Během našich experimentů jsme došli k závěru,...
|
|
|
Exprese CD47 a jeho topologie na povrchu primárních buněk karcinomu močového měchýře při interakci s makrofágy
Rajtmajerová, Marie ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
CD47 je tak zvaný "don't-eat-me" signál, který chrání buňky před fagocytózou. Jeho zvýšená exprese na nádorových buňkách otevírá novou možnost pro protinádorovou terapii. Monoklonální protilátky, které jsou dnes v klinických testech, blokují vazbu CD47 k inhibičnímu receptoru SIRPA na povrchu makrofágů, a tím zvyšují jejich fagocytickou funkční kapacitu. Proto umožňují pohlcení fagocytózou a následnou likvidaci nádorových buněk. To, zda bude buňka zlikvidována, závisí na úrovni celkové exprese, strukturní konformaci a stechiometrii CD47. Cílem mé diplomové práce je testování a příprava metod pro zmapování expresních parametrů CD47 metodou průtokové cytometrie (FCM), kvantitativní PCR (qPCR) a mikroskopie. K dosažení tohoto cíle jsem porovnala detailní vazebné vlastnosti komerčně dostupných protilátek v kompetičních testech na buněčných liniích. Po provedení tSNE analýzy jsem porovnala expresi CD47 s expresí dalších povrchových receptorů na primárních buňkách pacientů s karcinomem močového měchýře. Zde jsem se zaměřila na expresi CD47 v rámci diferenciačního kontinua nádoru. Abych lépe porozuměla vztahu mezi expresí CD47 a diferenciačním stádiem nádorové buňky, provedla jsem qPCR a porovnala expresi CD47 s vybranými transkripčními faktory. Následně jsem u dvou vybraných buněčných linií ověřila...
|
|
|
Proportional and functional characteristics of particular neutrophil subpopulations in umbilical cord and peripheral blood
Miková, Eliška ; Hrdý, Jiří (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Časné postnatální období se vyznačuje obecně nezralým fenotypem imunitního systému novorozence. Během tohoto období dochází k vývoji imunitního systému včetně nastavování imunitních reakcí, kde důležitou roli hraje setkávání imunitních buněk s prvotními bakteriemi kolonizujícími novorozence. V prvních dnech po narození je imunitní systém novorozence velmi omezený a adaptivní část je z velké části reprezentována protilátkami přenášenými z matky pupečníkovou krví v děloze, dále kolostrem a mateřským mlékem po porodu. Vrozená imunita, do značné míry tvořena neutrofily, proto hraje klíčovou roli v obranyschopnosti novorozenců. Cílem této studie je lepší pochopení biologie a fenotypu neutrofilů v pupečníkové krvi, ve srovnání s neutrofily z periferní krve matek a periferní krve zdravých netěhotných žen. Hodnocení fenotypu neutrofilů na základě exprese povrchových markerů bylo provedeno pomocí průtokové cytometrie. Exprese genů spojených s antimikrobiální funkcí byla měřena pomocí kvantitativní PCR. Funkční vlastnosti neutrofilů, metabolická aktivita během aktivace a fagocytózy a supresivní vlastnosti byli hodnoceny pomocí technologie SeaHorse a průtokové cytometrie. Výsledky předložené v této diplomové práci potvrzují přítomnost nezralých CD16low CD64high a CD16low CD62L+ subpopulací neutrofilů v...
|
|
|
Role apoptózy a nekrózy makrofágů mléčné žlázy skotu
Klimešová, Monika
Bakalářská práce Role apoptózy a nekrózy makrofágů mléčné žlázy skotu podává přehled o makrofázích, které jsou součástí nespecifické imunity. Popisuje jejich vývoj z pluripotentních buněk kostní dřeně přes monocyty k makrofágům a jejich význam v mléčné žláze, který zahrnuje fagocytózu mikroorganismů a odumřelých buněk, produkci cytokinů a stimulaci buněk, které regulují zánětlivé reakce. V další části je bakalářská práce zaměřena na jednotlivé typy buněčné smrti (apoptózu a nekrózu). Jsou zde popsány jejich strukturální, biochemické a genetické znaky a následné děje, které probíhají po odumření buněk, tj. odstranění odumřelých buněk z organismu. Neméně významný jsou rovněž následky odumřelých buněk na okolní tkáň. V závěru práce jsou shrnuty základní rozdíly mezi apoptózou a nekrózou a jejich role během zánětlivé reakce mléčné žlázy skotu.
|
|
| |
|
|
Virulenční faktory Entamoeba histolytica
Novotná, Monika ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Tůmová, Pavla (oponent)
Parazitický prvok Entamoeba histolytica způsobuje střevní onemocnění nazývané měňavková úplavice neboli amébóza, které patří mezi nejzávažnější celosvětová parazitární onemocnění vyskytující se převážně v rozvojových zemích. Cílem této bakalářské práce je shrnutí dosavadních poznatků o jednotlivých virulenčních faktorech E. histolytica. Jedná se především o adhezivní lektin Gal/GalNAc degradující cysteinové proteázy, fagocytózu apoptických buněk, amebapory tvořící póry v membránách cílových buněk a trogocytózu. Klíčová slova: virulenční faktory, Entamoeba histolytica, parazit, prvok, amébóza, lektin Gal/GalNAc, cysteinové proteázy, fagocytóza, trogocytóza, amebapor
|
|
|
Molekulární interakce Staphylococcus aureus s hostitelem
Cabrnochová, Marie ; Melter, Oto (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Cílem této práce je shrnout mechanizmy interakce Staphylococcus aureus s vybranými složkami vrozené imunity hostitele, z nichž k nejdůležitějším patří kolonizace hostitelské buňky a interakce S. aureus s neutrofily a procesy ovlivňující na bunečné úrovni kolonizaci hostitelské buňky. Povrchové proteiny patogena MSCRAMM interagující s proteiny na povrchu hostitelských buněk jako je například fibrinogen a keratin a tak zprostředkují adhezi k hostitelské buňce, která je podmínkou pro kolonizaci hostitelské buňky. Centrálním mechanizmem vrozené imunity vůči stafylokokové infekci je interakce S. aureus s neutrofily, které pomocí neutrofilové extracelulární pasti a fagocytózy buňky S. aureus likvidují. Zásadní roli při eliminaci bakteriální buňky ve fagozomu neutrofilů je kombinace lytického působení antimikrobiálních peptidů a produkce toxických kyslíkových radikálů. Obranné mechanizmy S. aureus proti působení imunitního systému jsou považované za faktory virulence, neboť přispívají ke vzniku infekce. Tyto mechanizmy jsou založeny na modifikací buněčné stěny, inhibicí chemotaxe neutrofilů a produkcí enzymů, které inhibují účinek antimikrobiálních peptidů, lysozymu, kyslíkových a dusíkových radikálů. Exprese těchto faktorů virulence u konkrétního kmene S. aureus a rizikové faktory na straně hostitele a...
|
|
|
Exprese CD47 a jeho topologie na povrchu primárních buněk karcinomu močového měchýře při interakci s makrofágy
Rajtmajerová, Marie ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
CD47 je tak zvaný "don't-eat-me" signál, který chrání buňky před fagocytózou. Jeho zvýšená exprese na nádorových buňkách otevírá novou možnost pro protinádorovou terapii. Monoklonální protilátky, které jsou dnes v klinických testech, blokují vazbu CD47 k inhibičnímu receptoru SIRPA na povrchu makrofágů, a tím zvyšují jejich fagocytickou funkční kapacitu. Proto umožňují pohlcení fagocytózou a následnou likvidaci nádorových buněk. To, zda bude buňka zlikvidována, závisí na úrovni celkové exprese, strukturní konformaci a stechiometrii CD47. Cílem mé diplomové práce je testování a příprava metod pro zmapování expresních parametrů CD47 metodou průtokové cytometrie (FCM), kvantitativní PCR (qPCR) a mikroskopie. K dosažení tohoto cíle jsem porovnala detailní vazebné vlastnosti komerčně dostupných protilátek v kompetičních testech na buněčných liniích. Po provedení tSNE analýzy jsem porovnala expresi CD47 s expresí dalších povrchových receptorů na primárních buňkách pacientů s karcinomem močového měchýře. Zde jsem se zaměřila na expresi CD47 v rámci diferenciačního kontinua nádoru. Abych lépe porozuměla vztahu mezi expresí CD47 a diferenciačním stádiem nádorové buňky, provedla jsem qPCR a porovnala expresi CD47 s vybranými transkripčními faktory. Následně jsem u dvou vybraných buněčných linií ověřila...
|
host ::
RSS.